本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。Phygene公司研制的內(nèi)毒素清除劑，可最大限度地除去內(nèi)毒素。從ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA，提取率達85-90%。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于細胞轉(zhuǎn)染等要求較高的實驗，以及其他各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液P1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

1、取ml細菌培養(yǎng)物，11000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

2、向留有菌體沉淀的離心管中加入4ml溶液P1(請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

3、向離心管中加入4ml溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細菌基因組DNA，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要超過5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。

4、向離心管中加入4ml溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。11000rpm離心10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5、加入上清1/5體積的冰上預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑，振蕩混勻，溶液變渾濁，冰浴2min至溶液變清亮。

6、37℃水浴5min,不時振蕩，溶液又變渾濁。11000rpm室溫離心5min，溶液應(yīng)分為兩相，上層水相含質(zhì)粒DNA，下層油相含內(nèi)毒素。

7、將含質(zhì)粒DNA的上層水相轉(zhuǎn)移至新管，棄下層油相，注意不要吸入油狀相。重復(fù)抽提三次，即重復(fù)步驟5-7三次。

8、加入12ml的結(jié)合液，充分混勻后加入吸附柱中，室溫放置2min，11000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。如果溶液量多可分多次加入。

9、向吸附柱中加入8ml漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

10、向吸附柱中加入6ml漂洗液，11000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

11、11000rpm離心3min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。

12、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加1-2ml經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，11000rpm離心2min。

13、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5min，11000rpm離心2min。

*Important Note:?This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.

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